Metabolic and molecular approaches for the integrated production of bioenergetic precursors in microalgae

Resumen

Las microalgas son microorganismos fotosintéticos con una gran capacidad de adaptación a condiciones adversas, desencadenando mecanismos de regulación con los que se mantienen ratios adecuadas de carbono y nitrógeno en la célula para su supervivencia. Cuando estos microorganismos son sometidos a condiciones de estrés ambiental, el carbono inicialmente dirigido a la formación de estructuras es redirigido a la síntesis de compuestos de reserva. Esta tesis doctoral se enmarca en la respuesta de la microalga Chlamydomonas reinhardtii ante la ausencia de nitrógeno en el medio de cultivo. Ante esta carencia nutricional, el carbono asimilado pasa a ser convertido a los dos compuestos principales de reserva: almidón y triacilgliceroles (TAG). Estos compuestos son de alto interés debido a su potencial como precursores en la producción de compuestos energéticos, tales como biocombustibles o intermediarios químicos en la industria. Otras biomoléculas de alto valor añadido generadas por las microalgas son los carotenoides, ampliamente utilizados en la industria farmacológica y de pigmentos por su carácter antioxidante. Así pues, el escalado a procesos sostenibles e integrados donde una única biomasa de microalgas pueda ser empleada para la obtención de varios productos susceptibles de comercialización, pasa por identificar y mejorar los principales cuellos de botella en el proceso de producción. En el caso de la obtención de almidón y TAG, su inducción en condiciones de estrés tiene como inconveniente la limitación en el crecimiento de los cultivos, ya que los recursos disponibles son dedicados a la acumulación de estos compuestos en lugar de la evolución y división natural de la célula. En el presente trabajo, se lleva a cabo por un lado, la mejora para la obtención de lípidos neutros mediante manipulación genética, sobreexpresando en Chlamydomonas reinhardtii un gen responsable del aumento del flujo de carbono aguas arriba de la ruta metabólica específica de síntesis de lípidos neutros (Capítulo 1), y por otro lado, sobreexpresando un gen directamente implicado en el ensamblaje de los triacilgliceroles (Capítulo 2). Además, se aborda la hipótesis de que la expresión simultánea de ambos genes puede llevar a una mejora superior a la que tendría sólo mejorar el aumento del flujo de carbono hacia la ruta (Capítulo 3). Por último, se estudia el aprovechamiento de la biomasa microalgal para la producción simultánea de carotenoides y almidón en carencia de nitrógeno y su utilización en la obtención de precursores químicos de interés industrial (Capítulo 4). En el Capítulo 1, se estudia el efecto de la sobreexpresión del gen endógeno que codifica la acetil-CoA sintetasa (ACS2) cloroplástica en Chlamydomonas, responsable de la producción, en un solo paso, de acetil-CoA desde acetato. El acetil-CoA, entre otros destinos metabólicos, alimenta la ruta de síntesis de ácidos grasos. Los resultados muestran un aumento en la síntesis de almidón en condiciones de cultivo repletas, además de un aumento de los intermediarios acil-CoA, los cuales son posteriormente incorporados a la ruta de síntesis de novo de triacilgliceroles. El paso de los cultivos a condiciones de carencia de nitrógeno provoca la síntesis de TAG en mayor proporción que la especie parental, además de detectarse mayores niveles de transcrito del gen ACS2 como consecuencia de su sobreexpresión. En el Capítulo 2, se aborda la expresión heteróloga en Chlamydomonas reinhardtii de un gen que codifica una diacilglicerol aciltransferasa de tipo 1 (DGAT1), procedente de la especie boraginácea Echium pitardii, que es responsable del último paso de ensamblaje de un acilo al esqueleto de diacilglicerol para formar una molécula de TAG. Se comprobó que el transformante posee mayor cantidad de ácidos grasos totales y un aumento significativo de la fracción de ácidos grasos neutros en condiciones de carencia de nitrógeno, además de un mayor consumo de acetato y presencia de glicerol intracelular con respecto a la especie parental. También se observa una degradación más lenta del aparato fotosintético. En el Capítulo 3, se realiza la obtención de transformantes acs, y a partir de éstos, la obtención de transformantes acs/dgat, con el fin de establecer una comparativa entre el transformante simple y el doble, que sobreexpresa simultáneamente ambos genes. Los resultados muestran un aumento sinérgico en lípidos neutros en el transformante doble seleccionado, mejorando tanto a la especie parental inicial como al transformante simple acs del que procede. Las dos especies transformadas presentan además una mayor cantidad de carotenoides y una mayor síntesis de almidón en medio repleto y carente de nitrógeno, y de nuevo, una mejor evolución de la eficiencia fotosintética en el transcurso de la carencia nutricional. Finalmente, en el Capítulo 4, se utiliza la capacidad de acumulación de almidón de Chlamydomonas reinhardtii bajo deficiencia de nitrógeno para la producción de los precursores químicos 5’-hidroximetilfurfural (5’-HMF) y ácido levulínico (LA). Estos intermediarios son ampliamente utilizados en industria para la síntesis de biocombustibles, aditivos, polímeros o sondas de diagnóstico por imagen. La aplicación de un diseño experimental y la metodología de Superficie de Respuesta, permitió determinar la influencia de los parámetros experimentales implicados en la hidrólisis ácida de almidón, en un primer paso a glucosa y posteriormente, a 5’-HMF y LA. Se seleccionaron las condiciones de temperatura, porcentaje de ácido, porcentaje de DMSO y tiempo de reacción para favorecer la síntesis de cada uno de los tres precursores. Además, la extracción de carotenoides previa a la hidrólisis, permite implementar las bases para un proceso de biorefinería integrada para la producción de varios compuestos a partir de una misma biomasa.