Desarrollo de metodologías analíticas para la determinación de moléculas de ácidos nucleicos basadas en la técnica icp-ms

Resumen

En las dos últimas décadas las técnicas de espectrometría de masas se han convertido en un referente para la determinación de metabolitos, péptidos y proteínas, mientras que su aplicación al análisis de ácidos nucleicos se ha limitado casi exclusivamente al estudio de los aductos formados por la interacción de determinados compuestos exógenos con el ADN. Sin embargo, con el desciframiento del Genoma Humano y el descubrimiento de nuevas moléculas de ácidos nucleicos con funciones reguladoras, se ha hecho evidente la necesidad de implantar metodologías analíticas que permitan detectar y cuantificar de una forma exacta y precisa cualquier modificación que ocurra en estas biomoléculas. En este contexto, el desarrollo de metodologías de separación combinadas con la detección mediante espectrometría de masas elemental con fuente de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS), se convierte en una prometedora herramienta de análisis debido a los excelentes parámetros analíticos que aporta; ya que el ICP-MS es un excelente detector especifico y muy sensible de heteroatomos. Por ello, en la presente Tesis doctoral se describen los trabajos realizados para el desarrollo de nuevas metodologías híbridas de electroforesis en gel (GE) y cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) con detección mediante ICP-MS para el estudio de ácidos nucleicos. En la introducción general se realizó una revisión del estado actual de las técnicas más habituales empleadas en el estudio de ácidos nucleicos, haciendo especial hincapié en las técnicas cromatográficas, electroforéticas y de espectrometría de masas. El primer capítulo resumió los trabajos realizados para la determinación de las modificaciones producidas por agentes oxidantes y quimioterápicos de nueva generación sobre las moléculas de ADN. Este objetivo se llevó a cabo a través de la aplicación de un sistema GE acoplado al detector ICP-MS, monitorizando la señal del 31P constitutivo del ADN. Se realizaron optimizaciones de los parámetros que pueden afectar a la separación y detección, y para ello se emplearon diferentes moléculas de ácidos nucleicos, centrándose especialmente en las moléculas de ADN plasmídico. En el segundo capítulo se recogieron los trabajos realizados para el desarrollo de una metodología de síntesis de sondas de oligonucleótidos de ADN con marcador metálico para la determinación de secuencias específicas de ADN mediante reconocimiento por reacción de hibridación. La determinación de los analitos se llevó a cabo a través de la separación mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) acoplada a un detector ICP-MS, monitorizando la señal del metal empleado como marcador de la sonda. En el tercer capítulo se aplicó la metodología de marcaje desarrollada en el capítuloII para la detección de moléculas de microARN en matrices biológicas de plasma, suero y leucocitos. Finalmente, se realizó una valoración crítica de los resultados obtenidos, proponiendo sugerencias para plan de trabajo futuro.