Estudio de la inhibición de la glutaminasaUna nueva aproximación terapeútica en la encefalopatía hepática

Resumen

Título: ESTUDIO DE LA INHIBICIÓN DE LA GLUTAMINASA: Una nueva aproximación terapéutica en la encefalopatía hepática. Doctoranda: María del Mar Díaz Herrero Directores: Juan D. Bautista Palomas, Olga María Cremades de Molina, Manolo Romero Gómez Resumen: La encefalopatía hepática (EH) es un síndrome neuropsiquiátrico complejo caracterizado por alteraciones de la conciencia y conducta, trastornos de personalidad, alteraciones electroencefalográficas, signos neurológicos fluctuantes; acumulación de manganeso en el cerebro, aparición de astrocitos Alzheimer tipos II, manifestaciones de estrés oxidativo u edema cerebral tras un daño hepático agudo o crónico. Una de las principales claves para entender el progreso de este síndrome incluye los cambios que tienen lugar en el cerebro debido al amonio y a la circulación sistémica del mismo. La principal fuente de amonio portal es el producido en el metabolismo intestinal de la glutamina y su deamidación por la glutaminasa del enterocito [Romero-Gómez et al., 2004]. Por lo que esta enzima es una diana muy prometedora para el tratamiento de esta patología. La L-glutamina L-amidohidrolasa (E.C. 3.5.1.2; GA) es una enzima principalmente mitocondrial y ubicua, encargada de la hidrólisis de la glutamina en glutamato y amonio. Existen dos genes de glutaminasa que codifican para las diferentes isoformas por splicing alternativo: el gen Gls del cromosoma 2 da lugar a las isoformas tipo K (kidney, KGA, GAM, CGA) y el gen Gls2 del cromosoma 12 a las tipo L (liver, LGA, GAB). Entre sus funciones está la participar en la hidrólisis de la glutamina en el intestino (digestión) y, por tanto, aporte de energía, formación de neurotransmisores (glutamato) en el cerebro), regulación de la acidosis metabólica en el riñón. También está sobreexpresada en las células tumorales, lo que se debe a que la glutamina es uno de los principales sustratos energéticos de estas células [Olalla et al., 2002; de la Rosa et al., 2009; McCauley et al, 1999; Windmueller y Spaeth, 1978; Schroeder et al., 2006; Márquez et al., 2009; Pérez-Gómez et al., 2005; Wang et al., 2010]. En este trabaja nos hemos centrado en el estudio de la glutaminasa mediante tres aproximaciones: Estudio de la actividad glutaminasa en diferentes tejidos en modelos de ratas cirróticas. Inicialmente utilizamos el modelo quirúrgico de ligadura biliar y más adelante cambiamos a un modelo de tratamiento crónico con tioacetamida (TAA, hepatotóxico) a una dosis de 0,03% TAA en agua ajustándola cada semana de acuerdo al peso a una razón ±20g / ± 0,015% TAA durante 12 semanas. Las ratas se sacrificaron a las 3, 6, 9 y 12 semanas. Los tejidos fueron procesados de acuerdo a lo procedimientos estándar de nuestro laboratorio y se midió actividad glutaminasa por el método de Heini [Heini et al., 1987]. Como puede observarse, a diferencia del modelo de ligadura biliar, donde sí se aprecian diferencia de actividad específica en los diferentes tejidos, en este modelo, salvo en el duodeno, no se aprecian diferencias de actividad específica estadísticamente significativas en los demás tejidos ni entre las ratas control y las tratadas. Sin embargo, en el duodeno sí se observa un aumento significativo (p<0,001) en las ratas tratadas con TAA a partir de la semana seis hasta la semana doce. Estos resultados son semejantes a los encontrados por otros investigadores en el modelo de derivación porto-cava [Ramos-Guerrero, 2004]. Las diferencias observadas entre el modelo de ligadura biliar y el de tratamiento con TAA, pueden atribuirse a diferencias entre los dos modelos, uno es modelo de daño hepático fulminante y el otro es modelo de cirrosis [Butterworth et al., 2009]. Identificación de la glutaminasa en diferentes tejidos: Este estudio se ha llevado a cabo con el fin de estudiar la expresión de la GA en los diferentes tejidos y obtener información sobre el papel de cada isoforma en cada uno de ellos, especialmente en lo referente a los dos isoformas mayoritarias, KGA y LGA. Para ello, hemos procedido al estudio de la expresión de la GA en los diferentes tejidos mediante inmunodetección y espectrometría de masas (MS). Hemos realizado electroforesis nativas (Blue-Native PAGE, BN-PAGE [Schägger y von Jagow, 1991; Wittig et al., 2006; Reisinger y Eichacker, 2006, 2007]) y desnaturalizantes (SDS-PAGE, [Laemmli, 1970]). Mediante la combinación de BN-PAGE y MS hemos identificado a la isoforma KGA en duodeno, riñon y ganglios como un hexámero de unos 400kD, y la LGA en el hígado como un tetrámero de unos 220kD. Hemos confirmado la presencia de la isoforma KGA en diferentes tejidos del cerebro (cerebelo, corteza, hipocampo y estriado) por SDS-PAGE y MS como una proteína de 74kD. Búsqueda de compuestos capaces de inhibir la actividad glutaminasa: Teniendo en cuenta que una de las principales causas de la EH es la hiperamonemia, una de las vías más prometedoras para combatir/tratar esta enfermedad es la basada en la reducción de los niveles plasmáticos de amonio, bien incrementando el uso del amonio (fundamentalmente en músculo), secuestrándolo mediante agentes específicos como el LOLA (L-Ornitina-L-Aspartato) o el OP (L-onitina-fenil-acetato) [Davies et al., 2009; Ytrebø et al., 2009], o evitando su producción excesiva. Dentro de este último tipo, el uso de inhibidores parciales de la GA intestinal tiene un gran interés, ya que la inhibición completa de la enzima no sería biológicamente viable, dado el papel crucial que esta enzima desempeña en el metabolismo energético del enterocito. Para ello, y como rutina de nuestro grupo, de manera sistemática en los últimos años venimos testando, frente a la actividad GA, tanto productos naturales como productos sintetizados en diferentes laboratorios, particularmente aquellos preparados por el Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla. Caracterizando y evaluando, tanto in vitro como en modelos celulares y animales aquellos que presenten actividad anti-GA. Dentro de toda la batería de productos ensayados sólo unos fue seleccionado: THDP-17 (Thiourea-Derivated Product 17, N-fenil-N¿-(3-metil-2-butenil) tiourea). Es un inhibidor acompetitivo complejo con una IC50 de 3,20 ± 0,02 µM. Para una concentración de 10 µM de THDP-17 se observa una inhibición de la GA del 57,39 ± 6,75. Si bien esta inhibición, dependiendo del tejido puede variar entre el 40 ± 5,46 % y el 80 ± 7,79 %. La actividad glutaminasa en cultivos celulares de Caco-2 en presencia de 100µM de THDP-17 se redujo en un 42%. Estudiamos la toxicidad del compuesto en ratones por administración oral, tanto en ayunas como en adlibitum, y obtuvimos una alta mortalidad, por lo que podemos concluir que es altamente tóxico. La discrepancia entre los datos de toxicidad en cultivos celulares y en ensayos in vivo en ratones, podría explicarse teniendo en cuenta que en cultivos celulares el producto entra en contacto directamente con la célula, sin ningún tipo de filtro previo, mientras que en los ensayos in vivo el producto está sometido a una acción metabólica a nivel gastrointestinal y hepático, lo que podría generar metabolitos más tóxicos que el producto. Es este resultado, al menos bajo nuestra opinión, el que resalta y potencia los ensayos in vivo frente a los ensayos en cultivos celulares tan en moda en los últimos años. También hemos ensayados compuestos que habitualmente se utilizan en el tratamiento de la EH como neomicina, rifaximina, metronidazol y los disacáridos no absorbibles lactulosa y lactitol. los productos habitualmente utilizados en clínica para el tratamiento de la EH no presentan efectos claros, in vitro, sobre la GA. Observándose una inhibición, del orden del 30% a concentración 0,1 mM, para la rifamixina; mientras que para la misma concentración, en el caso de la neomicina y los disacáridos no absorbibles (lactulosa y lactitol) lo que se observa es un aumento de actividad: 80% y 20%, respectivamente. Diversos estudios han relacionado las complicaciones de la cirrosis, como hepatocarcinoma y encefalopatía hepática, con la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) [Lai et al., 2012; Signal et al., 2006]. Además, observaciones clínicas ponen de manifiesto que los enfermos cirróticos con EH y diabetes, tratados con metformina, presentan una mejoría importante en relación con los síntomas encéfalo-hepáticos, frente a los no tratados con metformina. Por lo que decidimos estudiar si existía algún efecto de la metformina sobre la glutaminasa tanto in vitro como en cultivos celulares. A partir de concentraciones del orden de 10 mM, concentración teórica equivalente a la dosis de 875mg que se administra a pacientes diabéticos y que se alcanzaría si toda la dosis administrada fuera completamente absorbida y por lo tanto pasara a sangre, se comienza a observar una reducción de la actividad glutaminasa que llega a ser de un 16,88% ± 11,04, observándose el mayor grado de inhibición, 78,10% ± 15,88, para concentraciones de metformina del orden de 100 mM (p<0,05). La metformina se comporta como un inhibidor de tipo competitivo. En el cultivo de células Caco-2, la dosis de 20 mM de metformina disminuyó la actividad GA un 24% a las 72 horas (la producción de amonio en el medio se incrementó de 14,39+0,74 a 19,9+2,05 en presencia de metformina frente a 14,39+0,74 a 26,85+3,15 mM en el medio de cultivo con vehículo; p < 0,05) Conclusiones: 1. En el modelo de ligadura biliar, las ratas hiperamonémicas muestran diferencias claramente apreciables de actividad glutaminasa en todos los tejidos estudiados tras cuatro semanas de la operación. Sin embargo, en el modelo de tioacetamida, en las ratas con hiperamonemia no observamos diferencias significativas en la actividad glutaminasa en los diferentes tejidos salvo en el caso de la glutaminasa intestinal (duodeno). Reflejo, probablemente, del papel y la sensibilidad de esta enzima en este tejido y su importante papel en la fisiopatología de la EH. 2. Estudios mediante BN-PAGE revelan que la estructura nativa de la glutaminasa KGA es un héxamero de 400 kD de peso molecular, mientras que la isoforma LGA es un tetrámero de unos 220 kD. 3. Hemos identificado por espectrometría de masas, por primera vez, la isoforma KGA en extractos enriquecidos en mitocondrias de tejido cerebral, concretamente en cerebelo, hipocampo, estriado y corteza. 4. El THDP-17 es un inhibidor acompetitivo de la glutaminasa, tanto in vitro, donde presenta una inhibición del 60% a una concentración de 10 µM, como en cultivos celulares, donde presenta una inhibición del 70% a una concentración de 100 µM. Si bien, la utilización del THDP-17 para el tratamiento de la EH no es actualmente, viable debido a su toxicidad, consecuencia, probablemente, de la presencia del grupo tiourea en su estructura. Si bien, actualmente se está utilizando como molécula de partida para la obtención, por modificaciones químicas, de posibles inhibidores atóxicos de la GA. 5. Los productos habitualmente utilizados en clínica para el tratamiento de la EH no presentan efectos claros, in vitro, sobre la GA. Observándose una inhibición, del orden del 30% a concentración 0,1 mM, para la rifamixina; mientras que para la misma concentración, en el caso de la neomicina y los disacáridos no absorbibles (lactulosa y lactitol) lo que se observa es un aumento de actividad del 80% y 20%, respectivamente. 6. Pacientes cirróticos y diabéticos tratados con metformina experimentan una mejora en el grado de EH, que podría ser atribuido, en parte, a una inhibición parcial de la glutaminasa. Si bien, la utilización de metformina como fármaco oral requeriría la administración de cantidades mucho mayores a la dosis administrada a pacientes con diabetes (875mg). Por lo que serían necesarios más estudios, especialmente enfocados hacia el tipo de vía de administración, antes de proponerlo como fármaco utilizable en el tratamiento de la EH. 7. Teniendo en cuenta todos los resultados presentados y la información clínica y experimental disponible sobre la fisiopatología de la EH, concluimos que la inhibición de la GA constituye una de las vías más razonables y prometedoras para el tratamiento de la EH. Bibliografía: Butterwort R.F., Norenberg M.D., Felipo V., Ferenci P., Albrecht J., Blei A.T. (2009) Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver Int 29: 783-788. Davies N.A., Wright G., Ytrebø L.M., Stadbauer V., Fuskevåg O.M., Zwingmann C., Davies D.C., Habtesion A., Hodges S.J., Jalan R. (2009) L-ornitine and phenylacetate synergistically produce sustained reduction in ammonia and brain water in cirrhotic rats. Hepatology 50: 155-164. de la Rosa V., Campos-Sandoval J.A., Martín-Rufián M., Cardona C., Matés J.M., Segura J.A., Alonso F.J., Márquez J. (2009) A novel glutaminase isoform in mammalian tissues Neurochem Int 55: 76-84. Heini H.G., Gebhardt R., Brecht A., Mecke D. 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