Estudios de actividad anticáncer y anti-inflamatoria de compuestos bioactivos aislados de medios acuosos terrestres y marinos

Zusammenfassung

La biotecnología de microalgas se desarrollo por primera vez durante los años 60’s y ahora es un importante campo de estudio tanto para la investigación como para la industria. Actualmente, se conocen unas 30.000 especies de microalgas aunque apenas 12 son cultivadas a escala industrial, constituyendo una fuente natural de metabólitos secundarios. Además de sus diferentes historias evolutivas o las características especificas de los océanos, estos organismos adaptan su metabolismo a las distintas condiciones ambientales, generando productos naturales que poseen diferentes características estructurales con respecto a sus homólogos terrestres. Actualmente, las microalgas son consideradas fuentes de moléculas bioactivas, como carotenoides (β-caroteno, xantofilas, luteína, astaxantina), polisacaridos, ficobiliproteinas, vitaminas, compuestos fenólicos y volátiles y ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga. Estos compuestos han demostrado tener un prometedor potencial farmacológico por sus actividades anti-inflamatoria, antimicrobial, antiviral y antitumoral para el tratamiento de diferentes patologías como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), aterosclerosis, Parkinson, Alzheimer y cáncer. Los aceites del pescado son las principales fuentes de PUFAs n-3 debido a sus altos niveles de acido docosahexaenoico (DHA), acido eicosapentaenóico (EPA) y acido docosapentanoico (DPA), los cuales han demostrado muchos beneficios para la salud. Sin embargo, su uso clínico a menudo es limitado por su mal sabor y sus efectos secundarios como la flatulencia, halitosis, diarrea sanguinulenta y eruptos. Las microalgas son una gran fuente de diferentes ácidos grasos, incluyendo PUFAs como el acido linoleico (LNA), acido α-linolenico (ALA), EPA y DHA. Por lo tanto, las microalgas constituyen un potencial recurso no contaminante para la biotecnología y la bioingeniería de la producción de PUFAs como alternativa al aceite del pescado. Las oxilipinas (OXLs) son metabolitos producidos por la transformación oxidativa de ácidos grasos insaturados. Estos compuestos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, apareciendo en animales, plantas, musgos, algas, bacterias y hongos. En mamíferos, las oxilipinas son formadas principalmente por la vía del acido araquidónico y juegan un papel fundamental en el proceso inflamatorio y, en general, a diversas respuestas a estrés como infecciones, alergias y exposición a xenobióticos. Multitud de moléculas derivadas de ácidos grasos tienen un papel principal en la resolución de la inflamación; algunas de ellas (lipoxinas) son derivados de ácidos grasos endógenos, mientras que otros (resolvinas, protectinas y maresinas) son derivados de ácidos grasos de la dieta. Con respeto a las microalgas, la investigación en diatomeas ha demostrado que la oxidación de PUFAs seguida por una escisión de la molécula, conduce a una gran variedad de aldehídos poli-insaturados que participan en la defensa química contra su depredación. Se conoce poco mas sobre las OXLs de microalgas. En este trabajo, se ha investigado la actividad anti-inflamatoria, anti-oxidante y antitumoral de las OXLs aisladas de las microalgasChlamydomonas debaryana (Cd) yNannochloropsis gaditana (N1). Los compuestos estudiados fueron 13-HOTE, 13-HODE, 11-HHT, 9-HOTE, 16-HOTE, 11-HHT4 (Cd) and 15-HEPE (N1). La actividad biológica de estos compuestos se estudio para evaluar su potencial en la prevención de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y el desarrollo de cáncer colorectal. La actividad citotóxica de las OXLs en la línea de adenocarcinoma de colon humano HT-29 fue baja, y la actividad anti-oxidante (medidain vitro con el reactivo ABTS) fue moderada. Por el contrario, las OXLs mostraron una potente actividad anti-inflamatoria tanto in vitro como in vivo. La actividad anti-inflamatoria in vitro se midió en la línea celular de leucemia monocitaria aguda humana THP-1. Las siete OXLs causaron la disminución de la producción de las citocinas pro-inflamatorias: factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleucina 1β (IL-1β) e IL-6 en macrófagos THP-1 estimulados por LPS, de manera dosis dependiente. Estas citocinas son las primeras en ser secretadas por los monocitos y macrófagos una vez activados, e inducen la activación de los macrófagos intestinales, neutrófilos, fibroblastos y otras celulas que generan prostanoides, proteasas y muchos otros mediadores de la respuesta inflamatoria en los tejidos, incluyendo la producción de otras citocinas quimiotácticas. Además, las OXLs disminuyeron la producción de IL-8 en células HT- 29 activadas por TNF-a. Esta citocina es la principal producida por estas células, actuando como un potente quimioatrayente neutrofílico. La vía de señalización del factor nuclear kappa B (NFκB) estimula la expresión de múltiple moléculas relevantes para la patogénesis de varias enfermedades incluyendo la EII y el cáncer colorectal. NFκB es regulado por IκB. Tras la estimulación con varios agentes inflamatorios, la subunidad p50-p65 se transloca al núcleo y activa la transcripción de varios genes diana. El resultado es el aumento de la producción de moléculas pro-inflamatorias durante la fase activa de la EII, donde se incluyen las citocinas as IL-1, IL-6 and TNF-a. El efecto de las OXLs sobre la localización de NFκB, se estudio utilizando macrófagos THP-1 sin estimular o estimulados (LPS, 1mg ml-1) y células HT-29 sin estimular o estimuladas (TNF-a, 50 mg ml-1). En ambas líneas celulares, NFκB estaba principalmente localizado en el citoplasma en células no estimuladas, y principalmente en el núcleo en células estimuladas. El pretratamiento de las células con 13-HOTE, 13-HODE and 15-HEPE (100 μM) antes de la estimulación, disminuyo la localización nuclear de NFκB. Estos resultados sugieren que las OXLs disminuyeron la producción de citocinas, al menos en parte, por la inhibición de los efectos activados por la migración de NFκB al núcleo. Ciertos compuestos monohidroxilados derivados de la oxidación de PUFAs son conocidos como ligandos de receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPARs), una familia de factores de transcripción nucleares. Entre ellos, PPAR-γ es capaz de aminorar la expresión de citocinas inflamatorias y dirigir la diferenciación de células inmunes hacia fenotipos anti-inflamatorios. La microscopia confocal mostro que el tratamiento de macrófagos THP-1 y células HT-29 con 13-HOTE, 13-HODE y 15-HEPE (100 μM) causo una redistribución núcleo-citoplasmática de PPAR-γ, incrementando significativamente la localización nuclear frente a la localización citoplasmática con respecto a las células no tratadas. Los ligandos de PPAR-γ han demostrado inhibir la activación de la expresión de genes inflamatorios e interferir negativamente con las vías de señalización de factores de transcripción, como NFκB. Por tanto, las OXLs podrían reducir la producción de citocinas inflamatorias por medio de la activación de PPAR-γ, a través de mecanismos que podrían ser dependientes o independientes de la vía NFκB. La baja citotoxicidad de las OXLs de microalgas fue inesperada ya que una familia de OXLs vegetales (jasmonatos, metil jasmonato y algunos de sus derivados sintéticos) han mostrado actividad anti-cáncer contra células cancerosas de distinto origen histológico. Al no haber datos disponibles sobre los efectos del metil jasmonato (MJ) en células HT-29, se testo su citotoxicidad en esta línea celular y se encontro una baja citotoxicidad (IC50 = 3.47 ± 0.33 mM). No obstante, el MJ mejoro la citotoxicidad del 5-FU contra las células HT-29 disminuyendo a la mitad la cantidad de 5-FU necesaria para conseguir el mismo resultado. Esta mejora de los efectos del 5-FU puede permitir la reducción de la dosis administrada de este, la disminución de los indeseados efectos secundarios y la reducir la probabilidad de aparición de células resistentes a la terapia combinada. Por otro lado, el MJ mostro una actividad citotóxica mayor sobre células humanas de melanoma (AUCC62) (IC50 = 1.41 ± 0.01 mM). Además, encontramos que el MJ causo la depleción de los niveles de ATP en células HT-29 y AUCC62, tanto solo como en combinación con 2-deoxi-glucosa (2-DG), un inhibidor de la glucolisis, aunque el efecto fue mayor en la línea AUCC62, la cual tenía niveles basales de ATP mayores (sobre 4 veces mayor) y por tanto una mayor tasa metabólica. Las OXLs de microalgas (13-HOTE, 13-HODE, 11-HHT, 9-HOTE, 16-HOTE, 11-HHT4 and 15-HEPE) tuvieron también una mayor reducción de los niveles de ATP en la línea AUCC62 que en HT-29, tanto solas o en combinación con 2-DG. Este resultado sugiere que estas OXLs poseen un interesante potencial terapéutico contra células cancerosas con alta tasa de crecimiento y elevados requerimientos metabólicos. La actividad anti-inflamatoria in vivo de las OXLs de microalgas se llevo a cabo en modelos de colitis ulcerosa aguda y cronica sobre ratas. En primer lugar, se investigaron los efectos de un liofilizado, que contenía OXLs, deChlamydomonas debaryana y su principal oxilipina, 13-(S)-HOTE, en un modelo agudo de colitis experimental inducida por TNBS en ratas. Tanto liofilizado como 13-HOTE se administraron vía oral 48, 24 y 1 h antes de la inducción de la colitis y 24 h después, y los animales se sacrificaron a las 48 h. Los resultados mostraron, por primera vez, que estos productos podrian aliviar efectivamente la colitis inducida gracias a la producción de moco, inhibición de la infiltración neutrofílica y la producción de TNF-α, así como la supresión de COX-2 e iNOS de forma significativa. Los resultados sugieren que estos productos derivados de microalgas podrían ser una estrategia terapéutica emergente para el tratamiento de la fase activa de la colitis. La colitis crónica se produjo por administración intracolonica de TNBS durante dos semanas.