Desarrollo de métodos analíticos metabolómicos y metalómicos para el estudio de la enfermedad de Alzheimerdiseño de nuevos biomarcadores químicos de diagnosis

Resumen

La enfermedad de Alzheimer (EA) es el trastorno neurodegenerativo más común entre la población de edad avanzada, el cual se caracteriza por un inicio insidioso y un declive progresivo de las funciones cognitivas, En la actualidad no existe una cura para esta enfermedad en gran parte debido a que su etiología es aún desconocida, aunque existe la creciente evidencia de que pueden intervenir múltiples procesos patológicos, donde confluyen factores tanto genéticos como ambientales, o propios del envejecimiento. Además, las actuales pruebas de diagnóstico de la EA muestran grandes limitaciones, incluyendo una baja sensibilidad y especificidad, así como la imposibilidad de detectar de forma precoz la sintomatologia característica de esta enfermedad. Por todo ello, la identificación de nuevos biomarcadores diagnósticos es de vital importancia. El objetivo principal de esta Tesis fue la optimización de procedimientos metaboiómicos y metalómicos, y su posterior aplicación en el estudio de la etiología de la enfermedad de Alzheimer y el descubrimiento de potenciales biomarcadores de diagnóstico. Los métodos analíticos desarrollados en los trabajos que componen esta Tesis se basan en el empleo de la espectrometría de masas como técnica de detección, debido a su amplio rango de apíicabilidad, sensibilidad y especificidad. Con el fin de conseguii- una cobertura metabolómíca integral se optimizaron múltiples plataformas analíticas complementarias, incluyendo procedimientos de análisis directo mediante espectrometría de masas (DI-ESI-MS, FIA-APPI- MS) y su acoplamiento con distintas técnicas de separación ortogonales (UHPLC-MS, GC-MS, CE-MS). Las plataformas de análisis directo mostraron un gran potencial para realizar un primer screening metabòlico de múltiples fluidos y tejidos biológicos, gracias a su reducido tiempo de análisis y simplicidad instrumental. Posteriormente, las técnicas acopladas permitieron llevar a cabo una investigación más exhaustiva de la totalidad del metaboloma mediante el empleo de mecanismos de retención complementarios. Alternativamente, también se desarrolló un procedimiento metalómico basado en el fraccionamiento de metalo-especies según su peso molecular mediante precipitación de proteínas en condiciones no desnaturalizantes y posterior análisis en ICP-MS. La aplicación de estas técnicas metabolómicas y metalómicas en muestras de suero sanguíneo de pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer y deterioro cognitivo leve permitió identificar numerosos mecanismos patológicos relacionados con la patogénesis de esta enfermedad y su progresión desde etapas pre-clínicas. Así, algunos de los hallazgos más importantes de este estudio fue la detección de alteraciones significativas en la composición de lípidos de membrana, déficits en el metabolismo energético y sistemas de neurotransmisión, hiperamonemia, hiperiipidemia, estrés oxidativo, o una homeostasis alterada de múltiples elementos metálicos y metaloides, entre otros. A su vez, estas perturbaciones metabólicas también fueron observadas en múltiples compartimentos biológicos del modelo APPswe/PSÍAE9, incluyendo suero, cerebro, hígado, riñón, bazo y timo, evidenciando así la utilidad de este ratón transgénico para modelar la EA. La comparación de distintas regiones cerebrales demostró que las áreas más afectadas por la neuropatologia característica de esta enfermedad son el hipocampo y la corteza cerebral, aunque otras regiones también se vieron perturbadas en menor medida, incluyendo el estriado, cerebelo y bulbos olfatorios. Además, las alteraciones detectadas en los órganos periféricos (i.e. hígado, rifíón, bazo y timo) confirman la naturaleza sistèmica de este trastorno neurodegenerativo. Por último, se desarrolló un nuevo modelo de función inmune deteriorada basado en la depleción del gen de la interleucina-4 en APP/PS1 (APP/PS1/IL4-KO) con el objetivo de investigar los mecanismos subyacentes a la componente inflamatoria de la EA. Así, la aplicación de técnicas metabolómicas reveló alteraciones en la biosíntesis de histamina, el metabolismo de aminoácidos, producción de eicosanoides y fallos en el ciclo de la urea. De este modo, se puede concluir que la aplicación combinada de múltiples técnicas metabolómicas y metalómicas en distintas matrices biológicas, tanto de pacientes humanos como animales modelo, permite estudiar en profundidad la etiología asociada a la enfermedad de Alzheimer, y descubrir así posibles biomarcadores de diagnosis.