Optimización de herramientas moleculares para la manipulación genética de microalgas y su aplicación en procesos de biofloculación

Resumen

Las microalgas son un grupo muy diverso de microorganismos foto sintéticos y eucariotas. Poseen un alto potencial biotecnológico debido a que son productores de numerosos compuestos bioactivos de interés industrial. La recogida de biomasa de microalgas se vuelve particularmente importante debido a que es un paso crítico en el proceso de producción, representando alrededor del 20-30% del coste total y por tanto, su mejora es necesaria. En la presente tesis doctoral, se lleva a cabo el desarrollo y la optimización de herramientas moleculares para la manipulación genética de microalgas y su posterior aplicación en la mejora de los métodos de recogida de biomasa microalgal, a través de procesos de biofloculación. En el Capítulo 2, en Chlamydomonas reinhardtii, se evaluó la eficiencia de dos promotores heterólogos: el promotor CaMV35S del virus del mosaico de la coliflor y el promotor NOS, de la nopalina sintasa de Agrobactereium tumefaciens. El gen de resistencia a paramomicina {APHVIII) fue seleccionado como gen marcador. La eficiencia de transformación y los niveles de transcrito y proteína APHVIII, se analizaron en una serie de transformantes seleccionados. Los mayores valores se encontraron para el promotor NOS, seguido del promotor CaMV 35S. Aunque el uso de promotores heterólogos es una herramienta eficiente, la búsqueda de promotores endógenos podría ser una alternativa viable para encontrar un promotor universal y fuerte, propio de microalgas. En el Capítulo 3, se transformó genéticamente Chlamydomonas reinhardtii, utilizando el APHVIII como gen marcador, sin promotor. Los transformantes que exhibieron un fenotipo más fuerte se analizaron mediante PCR inversa y se identificó la región genómica precedente al gen marcador. En la mayoría de los transformantes analizados, el gen marcador se encontraba inserto en regiones intragénicas y su expresión se debió a una adecuada inserción en fase de lectura con los genes endógenos. En el Capítulo 4, los promotores heterólogos y el APHVIII promotorless utilizados en el capítulo 2 y 3, se emplearon para la transformación genética de Chlorella sorokiniana, una de las microalgas actualmente con mayor potencial y relevancia a nivel industrial. Se puso a punto el método de transformación génica mediante electroporación, definiéndose los parámetros óptimos como 2,5 kV de intensidad eléctrica y 3 pulsos. Una vez obtenidos los transformantes, se analizaron. Los resultados obtenidos mostraron los mejores valores de eficiencia utilizando el promotor CaMV 35S, en contraste con los resultados obtenidos para C reinhardtii, confirmando de este modo, que ios promotores heterólogos que se utilizan actualmente son fuertemente dependientes de cada especie. En los siguientes capítulos, tanto herramientas fisiológicas como moleculares son desarrolladas y optimizadas para la mejora de los métodos de biofloculación implicados en la recogida de biomasa de microalgas. En el Capítulo 5, la levadura altamente floculante Saccharomyces bayamis var. iivarum y sus factores floculantes son utilizados para inducir floculación en dos microalgas C. reinhardtii y Picochlorum sp, HM1. La adición de Saccharomyces y dichos factores, indujo agregación en las células de ambas especies, resultando en valores máximos de eficiencia de recuperación del 95% y 75% para Chlamydomonas y Picochlorum respectivamente. Con el fin de inducir fenotipos auto-floculantes en células de C reinhardtii, en el Capítulo 6, una cepa silvestre de esta clorofita, fue transformada genéticamente con uno de los genes dominantes responsables de la floculación en la levadura Saccharomyces bayanus var. uvarum, el gen FL05. De entre los muchos transformantes de C. reinhardtii analizados, tres de ellos: CrFL0511, CrFL0513 y CrFL0520, fueron identificados habiendo integrado establemente el gen de floculación en su genoma y exhibiendo fenotipos de auto-floculación.