Respuestas biológicas a contaminantes del entorno de doñana. Integración de metodologías ómicas que evalúan el estrés ambiental en animales de ecosistemas acuáticos

Resumen

La contaminación ambiental es uno de los mayores retos a los que se enfrenta el mundo actual. A medida que el impacto de las actividades humanas y los problemas de salud ambiental se convierten en globales en escala y extensión, la necesidad de identificar y hacer frente a los riesgos para la salud asociados a la contaminación se vuelve más urgente. Sin embargo, para realizar una actuación eficaz hay que comprender no sólo la magnitud del problema, sino también sus causas y los procesos subyacentes, pues solo así puede esa intervención enfocarse a donde más se necesita y donde puede ser más efectiva. El parque Nacional de Doñana (PND), fundado en 1969 y declarado Patrimonio de la Humanidad en 1981, es un ecosistema de marismas, arroyos y dunas de arena situado en la desembocadura del río Guadalquivir (SO de España), que alberga millones de aves migratorias y especies en peligro de extinción. Las marismas del PND se alimentan de los arroyos de la Rocina, el Partido y el Guadiamar y del río Guadalquivir. A pesar de ser un espacio protegido, el PND se ve amenazado por la presencia de áreas de agricultura intensiva localizadas en sus inmediaciones y por los polígonos industriales ubicados en la ría de Huelva (40 km al Oeste). Es, por tanto, esencial el desarrollo de nuevas herramientas para una evaluación preventiva de la salud ecológica del PND. Las respuestas a nivel molecular o celular en organismos centinela que habitan zonas contaminadas pueden dar información completa y biológicamente relevante del posible impacto de mezclas complejas de contaminantes tóxicos en la integridad del ecosistema. Ventajas importantes de esta aproximación son la capacidad de las especies bioindicadoras elegidas para detectar la aparición temprana diversas condiciones de estrés, y su utilidad para monitorizar la progresión o la regresión de esa perturbación ambiental a distintos niveles de organización biológica. Los biomarcadores "convencionales", como la medida de cambios de actividad de enzimas antioxidantes o biotransformadoras, tienen un sesgo importante para evaluar la contaminación, pues se centran solo en algunas respuestas biológicas, excluyendo otras cuya relación con la contaminación es aún desconocida. En contraposición, las tecnologías ómicas se están convirtiendo en una poderosa estrategia en estudios medioambientales. Las ómicas difieren de la investigación tradicional dirigida por hipótesis en que son aproximaciones para el descubrimiento de nuevas respuestas. En este sentido, la Proteómica Ambiental identifica las relaciones entre los cambios de expresión de proteínas y la contaminación. La determinación de cambios en los perfiles proteicos puede proporcionar una muy valiosa información sobre los mecanismos de respuesta a la exposición a un contaminante o cualquier otro factor de estrés ambiental. La metabolómica es otro método eficaz para evaluar el estado de salud de los organismos basado en la identificación de metabolitos de bajo Mr, cuya producción y niveles varían con el estado fisiológico, patológico o de desarrollo de células, tejidos, órganos o el organismo completo. Este trabajo se ha propuesto desarrollar algunas de estas nuevas herramientas analíticas para evaluar la salud ambiental de los ecosistemas que rodean al PND, para dar respuesta a la preocupación social originada por la supuesta presencia de contaminantes en el corazón del Parque. Se utilizó Procambarus clarkii como especie bioindicadora. Este crustáceo decápodo (cangrejo rojo) fue introducido en 1973 en la cuenca baja del Guadalquivir (SO España), donde su población alcanzó alta densidad. Su largo ciclo de vida, amplia distribución geográfica y sedentarismo, hacen de esta especie un buen bioindicador para evaluar los efectos de los contaminantes, tanto en condiciones controladas como en entornos reales. Este trabajo se ha propuesto desarrollar algunas de estas nuevas herramientas analíticas para evaluar la salud ambiental de los ecosistemas que rodean al PND, para dar respuesta a la preocupación social originada por la supuesta presencia de contaminantes en el corazón del Parque. Se utilizó Procambarus clarkii como especie bioindicadora. Este crustáceo decápodo (cangrejo rojo) fue introducido en 1973 en la cuenca baja del Guadalquivir (SO España), donde su población alcanzó alta densidad. Su largo ciclo de vida, amplia distribución geográfica y sedentarismo, hacen de esta especie un buen bioindicador para evaluar los efectos de los contaminantes, tanto en condiciones controladas como en entornos reales. Considerando las distintas actividades antropogénicas que amenazan al PND y las vías por las que los contaminantes pueden acceder a él, se capturaron ejemplares de P. clarkii en puntos clave de varios de los arroyos que alimentan los acuíferos del PND, y que traen aguas desde zonas urbanas o donde se practican labores de agricultura intensiva situadas en los alrededores. Al NE, las capturas se hicieron en la zona del Matochal (MAT) en las marismas entre el Guadiamar y el Guadalquivir, donde están los campos que producen la mayor parte del arroz de nuestro país. Hacia el NO, se capturaron animales en los arroyos del Partido (PAR) y la Rocina (ROC), donde se cultivan cítricos y fresas y se usan grandes cantidades de agroquímicos. Como referencia se capturaron animales en una laguna del interior del Parque (LP), en principio, alejada de las fuentes de contaminación. Hay una enorme deficiencia de conocimiento acerca de cómo la contaminación por agroquímicos está afectando la calidad medioambiental del Parque, pues este tipo de contaminación es difusa y difícil de evaluar. La agricultura convencional utiliza gran cantidad de productos agroquímicos (fertilizantes, herbicidas, insecticidas, pesticidas) que pueden causar la entrada inadvertida de metales pesados en el medio ambiente. Los metales son muy tóxicos para la vida acuática, ya que persisten en el ambiente y se acumulan en los organismos, por lo que se magnifican sus efectos a través de la cadena alimentaria. Varios estudios han demostrado que las especies reactivas de oxígeno y el estrés oxidativo juegan un papel clave en la toxicidad y carcinogenicidad de los metales, pues la exposición a metales afecta a los orgánulos y componentes celulares, como la membrana celular, mitocondria, lisosomas, retículo endoplasmático, el núcleo y algunas enzimas implicadas en el metabolismo, la desintoxicación y reparación del daño al DNA. Se usó la metodología ICP-MS para analizar el contenido de metales en tejidos de P. clarkii y los sedimentos de las zonas donde viven y que pueden ingerir, encontrándose una correlación directa entre los niveles de metales de la glándula digestiva y branquias y de los sedimentos. También se analizaron los daños oxidativos de lípidos y proteínas (carbonilación) y se midieron los niveles de tioles reversiblemente oxidados en residuos Cys proteicos, como indicadores de alteraciones en rutas de señalización controladas por el estatus redox celular. La acumulación de metales esenciales o tóxicos en los animales iba en paralelo con la cantidad de daños observados en lípidos y proteínas, y con una importante desregulación del estado de oxidación de tioles de muchas proteínas implicadas en estrés del retículo endoplásmico, defensa enzimática antioxidante, desbalance de la respiración mitocondrial, disminución de la tasa glucolítica y en un cambio metabólico que dirige la glucosa hacia la ruta de las pentosas fosfato, para generar poder reductor necesario para que funcionen las enzimas antioxidantes y el metabolismo de la glucosa. Para profundizar en el conocimiento de las alteraciones metabólicas causadas por la contaminación ambiental en los tejidos de P. clarkii, se llevó a cabo un estudio mediante proteómica cuantitativa (2DE-DIGE) para identificar cambios en los niveles de expresión de proteínas que pudieran dar nueva información sobre los mecanismos de toxicidad que se generan tras la exposición a contaminantes. Los cangrejos de zonas contaminadas presentaron alteraciones en los niveles de proteínas implicadas en el estrés oxidativo, procesos inflamatorios y de regulación epigenética de la expresión génica. En estos cangrejos se detectó un cambio metabólico dirigido hacia la glucolisis aerobia, para generar ATP y NADPH en una situación de estrés oxidativo que altera la integridad mitocondrial. Estas proteínas diferencialmente expresadas podrían servir como biomarcadores de exposición, además de permitir identificar los procesos metabólicos y fisiológicos alterados por los contaminantes presentes en PND y sus alrededores. Por último, para obtener información más completa sobre la respuesta bioquímica de P. clarkii a la exposición crónica a contaminantes ambientales, se usó la metabolómica como un método eficaz para evaluar el estado de salud de los organismos. Los resultados del estudio metabolómico mediante espectrometría QqQ-TOF-MS, corroboran y complementan los datos proteómicos. Los metabolitos cuyos niveles se vieron alterados por contaminación indicaban estrés oxidativo, disfunción metabólica y dislipidemia. Los estudios a gran escala utilizando ómicas se han aplicado con éxito para explorar las diferencias en la abundancia de metabolitos y proteínas y de modificaciones post-traduccionales que pueden sufrir éstas. Integrados con los datos bioquímicos, los resultados presentados en esta tesis dan un nuevo punto de vista sobre los procesos celulares que ocurren en células de organismos expuestos a contaminantes ambientales. La integración de las distintas aproximaciones omicas empleadas permite establecer que la exposición crónica de cangrejos de río P. clarkii a la contaminación provoca cambios en muchas funciones fisiológicas relacionadas con la defensa contra el estrés oxidativo, tales como el estrés del retículo endoplasmático, la inflamación y la respuesta inmune, y cambios en el metabolismo energético para adaptarse a una situación en la que la función mitocondrial se ve comprometida por el daño oxidativo en lípidos y membranas biológicas.