Efecto diferencial del calcitriol y del paricalcitol sobre el proceso de calcificación en celulas de musculo liso vascular. Mecanismos intracelulares implicados

Resumen

RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D./Dª El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis: 1. introducción o motivación de la tesis La primera causa de muerte en pacientes con Enfermedad Renal Crónica (ERC) es la enfermedad cardiovascular (ECV), siendo su índice al menos 20 veces más alto en pacientes en diálisis que en la población general (1). Los pacientes con ERC sufren hiperfosfatemia y otras alteraciones del metabolismo mineral que les conducen al desarrollo de Hiperparatiroidismo Secundario (HPT2o) y de calcificaciones vasculares (CV) (2,3); estas últimas contribuyen a la alta tasa de morbilidad y mortalidad cardiovascular observada en estos pacientes (4,5). La CV es un proceso activo que implica la transformación osteogénica de las células de músculo liso vascular (CMLV), aunque los mecanismos celulares y moleculares por los que ocurren no están completamente definidos. Se ha descrito que niveles elevados de fosfato inducen la calcificación y la diferenciación de las CMLV (6-8). El calcitriol (CTR), molécula empleada en el tratamiento del HPT2o en las últimas décadas, induce hipercalcemia y un aumento del producto calcio x fósforo (9, favoreciendo el desarrollo de CV (10,11). Actualmente, se vienen usando análogos de la vitamina D menos calcémicos como el paricalcitol (PC), que ha resultado ser efectivo en el tratamiento del HPTH2º sin inducir CV(10,12-14). No obstante, los mecanismos moleculares que median el efecto diferencial del calcitriol y del paricalcitol sobre las CV no están del todo claros. Uno de los objetivos de este estudio es determinar si los tratamientos con CTR o con PC modularán de manera desigual la calcificación, la transformación osteogénica y las vías de señalización intracelular relacionadas con la CV de las CMLV inducidas por niveles elevados de fosfato. Por otro lado, dos de los principales factores asociados al progreso y a la severidad de la ERC son la inflamación crónica (15-17) y el estrés oxidativo (EO) (18,19), los cuales se han relacionado también de manera causal con las CV (20-22). Sin embargo, no está claro en qué medida el fosfato ejerce un efecto directo y específico como agente pro-inflamatorio y pro-oxidante sobre las CMLV. Por lo tanto, otro objetivo del presente estudio es determinar si el fosfato elevado actúa directamente sobre las CMLV como un elemento generador de especies reactivas de oxígeno (EROs) e inductor de la respuesta proinflamatoria, además de esclarecer qué efecto ejercerían el CTR y el PC sobre la posible inducción de EO e inflamación por niveles elevados de fosfato. 2. Contenido de la investigación Se llevaron a cabo cultivos in vitro de CMLV durante 9 días con los siguientes grupos experimentales: Control, PO (3,3 mM fosfato), PO+CTR (10-8 M) y PO+PC (3x10-8 M) y se evaluó la diferenciación osteogénica mediante expresión génica y la calcificación. Asimismo, en relación con los mecanismos intracelulares implicados, se realizaron cultivos de 24 horas para valorar la influencia de estos grupos sobre la activación de la ruta canónica Wnt/ß-Catenina por western blot, microscopía confocal y expresión de genes diana de la ruta. Para evaluar el efecto de inhibir la ruta Wnt/ß-Catenina sobre la calcificación y la actividad de la ruta, se llevaron a cabo tratamientos de 24 horas con el inhibidor Dkk-1. Los grupos estudiados fueron: Control, PO, PO+CTR, PO+PC, PO+Dkk-1, PO+CTR+Dkk-1 y PO+PC+Dkk-1. La actividad de la ruta se midió mediante microscopía confocal y la expresión de genes diana de la ruta. Además, se incubaron CMLV durante 24 horas con los grupos Control, PO, PO+CTR y PO+PC para evaluar la generación de EROs y la activación de la vía de señalización canónica de NF¿ß mediante western blot y microscopía confocal. Asimismo, cultivos de 9 días fueron realizados para determinar expresión génica de marcadores inflamatorios, niveles de ICAM-1 por citometría de flujo y niveles de citoquinas secretadas al medio de cultivo por el ensayo Bio-Plex. Concentraciones más bajas de CTR (10-10 M y 10-12 M) fueron utilizadas para valorar su efecto sobre el estrés oxidativo y la inflamación; los grupos experimentales fueron: Control, PO, PO+CTR-8, PO+CTR-10 y PO+CTR-12. Tras 24 horas de cultivo se evaluaron la generación de EROs y la activación de la vía de señalización canónica de NF¿ß por western blot. 3.conclusión El desarrollo de calcificación y la diferenciación de CMLV a células de estirpe osteogénica que ocurre con niveles elevados de fosfato son mediados por la activación de la ruta canónica Wnt/ß-Catenina. La adición de CTR (10-8M) en condiciones de fosfato elevado produce una sobreactivación de la ruta Wnt/ß-Catenina, resultando en mayor calcificación y mayor diferenciación osteogénica. Sin embargo, el paricalcitol inhibe la activación de la ruta canónica Wnt/ß-Catenina, reduciendo la calcificación y la diferenciación osteogénica. Por otro lado, niveles elevados de fosfato producen un incremento en la producción de EROs, la activación de la ruta canónica de NF¿ß y un aumento en la expresión de ICAM-1 y de citoquinas inflamatorias (IL-1ß, IL-6, IL-8 y TNF-alfa) en CMLV. La adición de calcitriol (10-8M) a CMLV incubadas con fosfato elevado incrementa la producción de EROs, la activación de NF¿ß y la expresión de los marcadores inflamatorios ICAM-1, IL-6 y TNF¿. Por el contrario, el tratamiento con dosis más bajas de calcitriol (10-10 y 10-12 M) resulta en una reducción del estado inflamatorio y del estrés oxidativo. De igual forma el PC inhibe el estrés oxidativo, la activación de la vía NF¿ß y la expresión de marcadores inflamatorios en CMLV cultivadas con niveles elevados de fosfato.