Estudio de interacciones metal-biomolecula en organismos modelos Mus musculus/Mus spretus. Diagnosis de problemas ambientales

Resumen

La presencia creciente de una gran variedad de contaminantes químicos en el medio ambiente supone un riesgo para la salud de los organismos presentes en ellos y los correspondientes ecosistemas. La monitorización medioambiental convencional de los ecosistemas se lleva a cabo mediante análisis químico de elementos traza tóxicos (por ejemplo, Cd, As, Pb, Hg, etc), contaminantes orgánicos (plaguicidas, PCBs, PAHs), contaminantes emergentes (disruptores endocrinos, productos farmacéuticos, productos para el cuidado de la salud y detergentes) y, recientemente, las nanopartículas. Sin embargo, los análisis químicos tradicionales no permitan conocer si los niveles de contaminantes químicos presentes en el medio ambiente provocan efectos sobre los organismos, especialmente considerando su acción conjunta, y si suponen una amenaza real para los ecosistemas. Todo esto ha provocado el desarrollo de una serie de metodologías que evalúan respuestas biológicas asociadas a la contaminación en organismos vivos usados como bioindicadores de contaminación ambiental, ya que estos reflejan el efecto de los contaminantes sobre el metabolismo celular y la homeostasis global. Entre estas metodologías se encuentran el uso de biomarcadores, parámetros biológicos medidos en los organismos expuestos (bioindicadores) los cuales indican, al alterarse sus niveles, la exposición a contaminantes, sus efectos biológicos o los riesgos de su presencia en los ecosistemas. La evaluación de biomarcadores en organismos vivos puede ayudar a diagnosticar el impacto y riesgo de los contaminantes en los organismos, poblaciones o ecosistemas. El presente estudio considera la evaluación y seguimiento de la contaminación ambiental del Parque Nacional de Dofiana y sus alrededores (situado en la zona suroeste de España). Este entorno natural que fue declarado Reserva de la Biosfera, es un mosaico de ecosistemas con un grado de biodiversidad único en Europa. Sin embargo, está amenazado por diversos factores concurrentes, como las actividades agrícolas desarrolladas en su entorno, la influencia de zonas industriales próximas (Polo Químico de Huelva) y los riesgos derivados de la actividad minera, como demostró el vertido de las Minas de Aznalcollar en 1998. El presente trabajo se ha llevado a cabo en 5 zonas diferentes del Parque Nacional de Doñana y alrededores: Lucio del Palacio (LDP), situado en el interior del Parque, considerada zona no contaminada y utilizada como control y otras 4 zonas situadas en el entorno del Parque, La Rocina (ROC), El Partido (PAR), El Ajolí (AJO) y El Matochal (MAT), con diferentes niveles de contaminación dependiendo de su proximidad a zonas de actividad agrícola, minera o industrial. Se ha usado como especie bioindicadora el ratón de vida libre Mus spretus, que es una especie muy prolífica en estas zonas. Se ha demostrado experimentalmente que el ratón de vida libre Mus spretus es genéticamente homólogo al ratón de laboratorio Mus muscuíus, ya secuenciado, lo que permite utilizar información proteómica y metalómica de Mus muscuíus para identificar proteínas expresadas en el Mus spretus. El estudio de la contaminación ambiental del Parque Nacional de Dofiana y alrededores se ha llevado a cabo mediante el análisis de biomarcadores relacionados con el estrés ambiental, concretamente metalobiomoléculas, utilizando Mus spretus capturado en las cinco zonas de estudio previamente mencionadas. Para ello se ha desarrollado un procedimiento metalómico basado en el acoplamiento de la cromatografía de exclusión de tamaño con detección elemental ICP-MS, el cual se ha aplicado a los extractos citosólicos de diferentes órganos de este ratón (cerebro, hígado y riñón) con objeto de identificar posibles cambios de expresión de metalobiomoléculas como consecuencia de la contaminación ambiental. A su vez, se han llevado a cabo separadamente experimentos de exposición a Cd, As y Hg en Mus muscuíus, con objeto de obtener información de la respuesta biológica de estos organismos modelo, es decir, cambios de expresión de metalobiomoléculas como consecuencia de la exposición a estos contaminantes, y posteriormente comparar estos resultados con aquellos obtenidos en Mus spretus. Para ello, una vez finalizados cada uno de los experimentos de exposición, se analizaron los correspondientes extractos citosólicos de los diferentes órganos de Mus muscuíus (cerebro, hígado y riñón) usando el mismo procedimiento metalómico mencionado anteriormente. El estudio metalómico comparativo de la respuesta biológica de Mus muscuíus sometido a experiencias de exposición y Mus spretus procedente de las zonas de estudio, muestra la sobreexpresión predominante de una fracción que contiene Cd, Cu y Zn, correspondiente a la presencia de metalotioneina, y otra fracción que contiene Cu y Zn correspondiente a la superóxido dismutasa, ambas presentes en hígado y riñón de Mus spretus en las zonas contaminadas ROC y MAT. La presencia de As en esta zonas contaminadas provoca la presencia de especies arsenicales metiladas como MMA y DMA en el hígado y riñón de Mus spretus. Estos resultados indican la interacción de estos metales tóxicos que abundan en las zonas contaminadas con los organismos de vida libre que habitan en ellas. La ausencia de respuesta biológica de Mus spretus en relación a la presencia de Hg confirma la baja incidencia medioambiental de dicho elemento en las áreas consideradas. Los resultados en cerebro no muestran diferencias significativas entre los perfiles de Mus spretus en zonas contaminadas y no contaminadas, posiblemente debido a la actividad de la barrera hematoencefálica que protege dicho órgano. La aplicación de este procedimiento metalómico a las especies Mus spretus /Mus musculus, constituye una buena aproximación analítica para el estudio de la biodisponibilidad y el impacto medioambiental de los metales en los organismos vivos, utilizando la medida de la respuesta biológica de estos frente al estrés medioambiental. Por otro lado, en relación a lo anterior, se ha llevado a cabo el estudio de los complejos metálicos de las metalotioneinas (MT) que se forman en las células hepáticas de Mus musculus sometido a experiencias de exposición a cadmio. Dicho experimento se ha llevado a cabo mediante inyección subcutánea de dosis crecientes de cadmio (en forma de CdCy desde 0,1 a 1 mg/Kg/día durante un total de 10 días. Se consideran tres subgrupos de ratones, A, B y C, correspondientes a subcolonias separadas y sacrificadas los días 2, 6 y 10 de exposición, respectivamente. Por otro lado, se utilizó un grupo control al que se le inyectó subcutáneamente 100 \iL de agua ultrapura diariamente, durante los 10 días del experimento. Los extractos de hígado de Mus musculus de los dos grupos más expuesto, B y C, fueron analizados usando un procedimiento metalómico basado en el uso de un sistema cromatográfico bidimensional, SEC-RPC, acoplado a un sistema de detección elemental como ICP-MS, y en paralelo con un sistema de detección molecular nESI-qTOF-MS, con objeto de aislar, purificar e identificar los complejos metálicos de las metalotioneinas formados durante el experimento de exposición. Los resultados nos permite establecer cambios estequiométricos de los complejos de Cd, Cu y Zn con las isoformas I y II de la metalotioneina a lo largo de la exposición a cadmio, observándose a mitad del experimento la presencia de isoformas parcialmente coordinadas con átomos de Cd (número de átomos de Cd inferior a 7), coexistiendo en la misma molécula con átomos de Cu y Zn. Sin embargo, al progresar la exposición a Cd dichas isoformas evolucionan a especies en las que el Cd ocupa todas las posiciones de coordinación de las MTs (Cd7MT). A su vez, los resultados muestran una mayor afinidad del Cd por la MT I que por la MT II ya que se ha podido observar señales correspondientes a los complejos de MT II con un número de átomos de cadmio inferior al observado para los complejos de MT I. Todos estos resultados proporcionan información sobre evolución de la estequiometria de metales unidos a diferentes isoformas de metalotioneina y la interacción cooperativa entre metales y biomoléculas en las células, como la sustitución de cobre o zinc por cadmio, en hígado de Mus muscuíus a lo largo de la exposición a dosis crecientes de este elemento. El estudio en profundidad de estos complejos metálicos pueden ayudar a esclarecer el papel biológico de las MTs, y los resultados obtenidos se pueden extrapolar a la especie de vida libre, como el Mus spretus, para evaluar la respuesta biológica relacionada con las MTs a largo plazo. De esta forma, se puede evaluar de forma integrada, el impacto de la contaminación ambiental en ecosistemas amenazados.