Tetraselmis chuiimodificación genética y estrategias para el incremento de su contenido lipídico

Resumen

Las microalgas son organismos fotosintéticos unicelulares con un gran potencial biotecnológico gracias a sus altas tasas de productividad. Actualmente se plantea su utilización en la producción de compuestos de interés industrial como ácidos grasos poliinsaturados de larga cadena o carotenos. Incluso, se plantea su uso como fuente de energía limpia y renovable, como por ejemplo, para la producción de biodiesel. Pero, a pesar de las numerosas líneas de investigación abiertas, el problema principal que limita su desarrollo son los altos costes productivos a escala industrial, obteniendo productos excesivamente caros y no competitivos a nivel de mercado. La inviabilidad económica de la producción de biomasa microalgal, y/o de compuestos derivada de la misma, se podría solventar mediante un mayor desarrollo de la biotecnología de microalgas, pudiendo emplearse herramientas tan diversas como la optimización de los procesos de cultivo y procesamiento de esta biomasa y estrategias de mejora a través de la ingeniería genética de especies. Una de las herramientas fundamentales de la ingeniería genética de especies es la transformación genética de las mismas. Esta herramienta multipropósito podría plantearse como la solución a muchos de los problemas que impiden la existencia de microalgas industrialmente competitivas. Este hecho, ha motivado el primer objetivo de esta tesis doctoral: establecer un protocolo de transformación genética nuclear estable en una microalga de potencial industrial probado, como es Tetraselmis chuii, especie marina perteneciente al filo Chlorophyta. Pero además, quisimos demostrar la utilidad de esta herramienta de ingeniería genética mediante una “prueba de concepto”, es decir, desarrollar una estrategia de mejora vía ingeniería genética para una posible aplicación industrial. Dentro de la biotecnología de microalgas uno de los aspectos que capta mayor interés, es su utilización para la producción de biodiesel, pero, al problema ya comentado de la inviabilidad económica, se suma que no se han identificado especies con altas tasas de crecimiento que acumulen altos contenidos en triacilgliceroles (materia prima del biodiesel), ambos, requisitos indispensables para la viabilidad de este enfoque. Partiendo de la hipótesis de que la ingeniería genética de microalgas podría generar cepas transgénicas que acumulen un mayor contenido en triacilgliceroles (TAG) sin comprometer el crecimiento, transformamos genéticamente T. chuii con dos genes claves en la síntesis de TAG: genes codificantes para la diacilglicerol aciltranferasa tipo 1 (DGAT1) y tipo 2 (DGAT2). Ambos genes dan lugar a enzimas que catalizan el último paso de síntesis de TAG, y cuya sobreexpresión en plantas ha dado lugar a incrementos notables en aceites de semillas. En esta tesis doctoral se detalla el desarrollo de un protocolo de transformación nuclear de T. chuii vía Agrobacterium tumefaciens. Esta metodología de transformación utiliza una bacteria (A. tumefaciens) como herramienta de transformación, que es capaz de infectar células transfiriendo un segmento concreto de DNA (T-DNA) al genoma de la célula infectada. Una vez establecido el protocolo de transformación, y verificada la transformación de los clones transgénicos obtenidos (mediante PCR y funcionalidad de los genes insertados), se llevó a cabo la optimización de la metodología de transformación con la finalidad de obtener la máxima eficiencia posible. El primer paso fue la identificación de los factores críticos que influían en el proceso, donde, de 7 factores testados, 3 resultaron ser críticos: pH, temperatura y la interacción de acetosiringona con el tiempo de co-cultivo. Una vez identificados los factores de mayor influencia en la eficiencia de transformación, se procedió a la determinación del valor óptimo de los mismos, obteniendo que la máxima eficiencia de transformación se producía a pH de 5, temperatura de 27ºC y una concentración de AS de 150 µM en el co-cultivo. La eficiencia de transformación obtenida fue de 1,5±0,93x10-4. Queda demostrado en esta tesis doctoral el desarrollo de un protocolo de transformación genética eficaz, robusto, estable y reproducible para la especie marina T. chuii, lo que posibilita el desarrollo de la producción biotecnológica de cualquier substancia de interés en esta especie microalgal. Posteriormente, se realizó la transformación genética de esta microalga con dos genes DGAT, concretamente EpDGAT1 de Echium pitardii (Boraginaceae) y ScDGAT2 de Saccharomyces cerevisiae, ambos, dirigidos por un promotor quimérico (Hsp70A:RbcS2:Int) procedente de Chlamydomonas reinhardtii de eficiencia probada en distintas microalgas. Una vez verificada la presencia de los genes DGAT en el genoma de los clones transformados y la expresión de los mismos, procedimos al análisis del contenido lipídico de los clones transgénicos obtenidos. Para ello, se diseño la siguiente metodología de selección: un análisis inicial de 50 clones transformados con cada DGAT, mediante cultivos por triplicado de cada clon, donde determinamos el contenido en ácidos grasos totales mediante transmetilación directa de la biomasa y cromatografía de gases, los resultados obtenidos se compararon con la cepa silvestre original para seleccionar aquellos clones con un aumento destacable en el contenido de ácidos grasos totales. Una vez seleccionados los clones "interesantes", procedimos al análisis del contenido en ácidos grasos del extracto lipídico, de las fracciones lipídicas (lípidos neutros, galactolípidos y fosfolípidos) y de los TAG de los clones transgénicos, pudiendo determinar si se había producido un incremento o no del contenido en lípidos neutros y específicamente de TAG. Estos análisis, se realizaron por duplicado, y en el caso concreto del análisis de TAG, se realizó mediante cromatografía en capa fina (n=4) y posterior cromatografía de gases. En la primera etapa de selección, seleccionamos 4 clones EpDGAT1 con incrementos que oscilaban entre el 20-40% en ácidos grasos totales con respecto a la cepa silvestre, y 8 clones ScDGAT2 con incrementos que iban del 30% hasta el 75% en ácidos grasos. Estos clones fueron analizados en más detalle, obteniendo que 2/4 clones EpDGAT1 analizados presentaron incrementos importantes en el extracto lipídico, lípidos neutros y TAG, concretamente, con incrementos del 61% y del 75% en TAG en comparación con la cepa silvestre. En el caso de los 8 clones ScDGAT2 analizados, 3/8 clones mostraron incrementos en ácidos grasos totales con respecto a la cepa silvestre en todos los análisis realizados, en este caso, el incremento obtenido en TAG fue del 111%, 105% y 32%. Es destacable que en algunos de los clones analizados el contenido en TAG estimado superó el contenido en ácidos grasos totales del extracto lipídico de la cepa silvestre. Queda demostrado el éxito de esta estrategia de mejora vía ingeniería genética en microalgas, estrategia que ha sido probada en contadas ocasiones, hasta ahora, en otras especies microalgales sin llegar a obtener resultados tan remarcables como el incremento del 111% en TAG alcanzado en T. chuii y sin aplicar condiciones de estrés en el cultivo. La viabilidad de este enfoque de mejora, ha demostrado que a través de la ingeniería genética de microalgas se pueden obtener cepas transgénicas con mayores contenidos en TAG sin afectar negativamente a las tasas de crecimiento. Se concluye que es un procedimiento útil para desarrollar la producción biotecnológica de substancias de interés industrial en microalgas.