Genetic and molecular control of monoecy stability, fruit set and fruit quality in watermelon

Resumen

Citrullus lanatus y otras especies de la familia Cucurbitaceae han evolucionado hacia el desarrollo de flores unisexuales femeninas y masculinas a partir de especies con flores hermafroditas. La distribución y ocurrencia de flores femeninas, masculinas, y bisexuales y hermafroditas a lo largo de los tallos principales y secundarios definen tres morfotipos sexuales en sandía: monoecia (la planta produce flores masculinas y femeninas), andromonoecia (la planta produce flores masculinas y hermafroditas), y andromonoecia parcial (la planta produce flores masculinas, femeninas, bisexuales y hermafroditas). El objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido estudiar el control genético y molecular de la monoecia y la andromonoecia total y parcial en sandía. Para estudiar el control genético de la andromonoecia completa se realizó un análisis de segregación de tres poblaciones F2 independientes procedentes del cruce entre tres líneas monoicas y una línea andromonoica. Se ha demostrado que la andromonoecia está controlada por un solo gen con dos alelos, M que confieren monoecia, y m que confiere andromonoecia. El alelo M es semi-dominante con respecto al alelo m, pues las plantas heterocigóticas (Mm) fenotipo parcialmente andromonoico y no solo producen flores femeninas sino también flores bisexuales y hermafroditas. En otras especies de cucurbitáceas, la andromonoecia está causada por mutaciones de falta de función en los genes de biosíntesis de etileno CmACS7, CsACS2 y CpACS27A de melón, pepino y calabacín, respectivamente. En sandía hemos clonado y caracterizado el gen homólogo CitACS4, que codifica para una enzima ACS tipo III que se expresa predominantemente en flores pistiladas. En la línea andromonoica detectamos una mutación sin sentido en un residuo altamente conservado de CitACS4 (C364W) que cosegrega con el fenotipo andromonoico en las tres poblaciones F2 estudiadas. Estos datos indican que CitACS4 debe estar involucrado en la biosíntesis de etileno requerida para la inhibición del crecimiento del estambre durante el desarrollo de las flores femeninas. La mutación C364W reduce la producción de etileno en los botones florales pistilados, promoviendo la conversión de las flores femeninas en flores hermafroditas, por lo tanto, de monoecia (genotipo MM) en andromonoecia parcial (genotipo Mm) o andromonoecia (genotipo mm). De forma paralela hemos estudiado si el gen CitACS4 podría también estar involucrado en otros caracteres regulados por etileno durante el desarrollo de flores y frutos, incluyendo la transición de la floración pistilada, el número de flores femeninas por planta, el desarrollo de los órganos florales, y el cuajado y desarrollo de frutos y semillas. Para ello, estos caracteres se han fenotipado en las tres poblaciones segregantes para los dos alelos del gen CitACS4 (M, monoico; m, andromonoico). El alelo m del gen CitACS4, además de conferir el tipo sexual andromonoico, cosegregaba con una transición floral más temprana, un aumento del porcentaje de flores pistiladas por planta, una reducción del crecimiento y maduración de los carpelos y pétalos, así como con un retraso de la maduración y apertura de las flores pistiladas. Se encontró que el alelo de la andromonoecia estaba también asociado con una reducción del cuajado de frutos y semillas, y que esa falta de cuajado no estaba causada por una deficiencia en la polinización. El gen CitACS4 también afectó las tasas de crecimiento longitudinal y transversal del ovario y fruto, lo que significa que los frutos de plantas andromonoicas (mm) eran más redondos que las de las plantas monoicas (MM). En su conjunto, todos estos datos demostraban que el locus definido por la biosíntesis de etileno y el gen determinante del sexo CitACS4 actúa como un regulador pleiotrópico del desarrollo completo de la flor pistilada y el desarrollo temprano del fruto. En la última parte de este trabajo de tesis, se realizó un estudio de la andromonoecia parcial en sandía. Se ha fenotipado y genotipado (para el locus M/m) un panel de 207 accesiones de Citrullus lanatus de todas partes del mundo, incluyendo entre ellas cinco líneas puras e híbridos comerciales. Encontramos varias accesiones que a pesar de ser MM tenían un fenotipo parcialmente andromonoico en varios lugares y años diferentes. Un análisis de cosegregación entre una variante alélica de CitACS4 y el fenotipo parcialmente andromonoico, demostró que la aparición de flores bisexuales y hermafroditas en una línea parcialmente andromonoica de sandía no dependía de CitACS4, sino que estaba conferida por un gen recesivo no ligado al que hemos llamado pa. Se llevaron a cabo dos estrategias diferentes para mapear el gen pa en el genoma de C. lanatus: la secuenciación masiva de bulks segregantes (BSA-seq) y el estudio de asociación del genoma completo (GWAS). El estudio BSA-seq se realizó utilizando el ADN de dos grupos contrastantes de una población F2, el grupo monoico M y el grupo parcialmente andromonoico PA, cada uno generado a partir de ADN de 20 plantas F2 monoicas o parcialmente andromonoicas, respectivamente. Los análisis de GWAS se realizaron con datos de genotipado por secuenciación GBS en 122 accesiones procedentes del USDA. La combinación de las dos estrategias indicaba que el locus pa mapea en una región genómica que se expande entre 32.24-36.44 Mb en el cromosoma 1 de sandía. El mapeo fino redujo el locus pa a una región genómica de 867 Kb que contiene 101 genes. Finalmente, se seleccionaron varios genes candidatos, por su función en la biosíntesis y la señalización de etileno, así como en el desarrollo de las flores y la determinación del sexo, pero también por el impacto de las mutaciones detectadas entre los dos grupos de ADN secuenciados.