Determinación de residuos de fármacos y sus metabolitos en plantas silvestres. Ensayos de exposición y evaluación de la bioactividad

Resumen

Actualmente la presencia de sustancias farmacológicas en las aguas empleadas para el regadío o en las matrices vegetales es una problemática para el medioambiente, siendo cada vez, más necesario evaluar, monitorizar y realizar un diagnostico medioambiental de las zonas afectadas por la contaminación para conocer los ecosistemas dañados por la presencia de los contaminantes y así evaluar la consecuencia de estos en los seres vivos. Por ello, esta Tesis centra su estudio en los efectos de la contaminación sobre la flora autóctona del Parque Nacional de Doñana, aportando datos cualitativos y cuantitativos al efecto de sustancias farmacológicamente activas (como los contaminantes emergentes) en tres especies de plantas de esta zona, además los estudios al respecto son prácticamente inexistentes. Este trabajo pretende incrementar el conocimiento sobre las consecuencias de la presión antropogénica en el ecosistema del Parque Nacional de Doñana, simulando a escala de laboratorio la presencia de los principales activos farmacológicos, sus compuestos de degradación y metabolitos, en matrices vegetales de este entorno natural, evaluando también la capacidad antioxidante y enzimática así como la identificación de moléculas inhibidoras de dichas enzimas en una colección de 150 plantas del mencionado entorno protegido. Se ha optimizado y validado un procedimiento analítico utilizando cromatografía líquida de alta resolución con detección de espectrometría de masas-tiempo de vuelo para la para para la detección identificación y la cuantificación de seis principios activos farmacológicos, carbamazepina, flumequina, ciprofloxacina, enrofloxacina, ibuprofeno y diclofenaco, en extractos de tres especies vegetales: Lavandula dentata, Juncus sp. y Salicornia europaea, especies presentes en diferentes hábitats del parque Nacional de Doñana (España). El procedimiento permite recuperaciones de entre el 60 y el 100% para la carbamazepina en todas las matrices, alrededor del 70% para enrofloxacina y ciprofloxacina, del 70% para ibuprofeno y entre el 80 y el 90% para diclofenaco. Se ha diseñado y realizado un ensayo de exposición sometiendo ejemplares de las especies vegetales seleccionadas a riegos con disoluciones acuosas conteniendo concentraciones variables de los principios activos ya mencionados. Se han analizado las diferentes partes de las plantes realizando cortes a los 7, 15, 21 y 30 días (fin del ensayo) y determinando la absorción de los mismos en las diferentes partes de la planta. Con técnicas de análisis no dirigido se han evaluado las muestras sometidas a los ensayos de exposición e identificar y, en su caso determinar, metabolitos y productos de degradación. Se han evaluado las cantidades de principio acumuladas en las diferentes partes de las plantas a lo largo del ensayo de exposición, identificando los posibles metabolitos generados en las diferentes partes de las plantas sometidas al ensayo de exposición, y las principales rutas metabólicas que pudieran estar implicadas, mediante el análisis masivo de los datos cromatográficos a través de un software apropiado (Metabolynx TM), atendiendo los resultados a la concentración de principios activos en el agua de riego, tiempo de ensayo, parte de la planta y evolución fisiológica aparente de los ejemplares vegetales. Adicionalmente se optimizaron métodos para evaluar las actividades antioxidantes e inhibidoras, empleando diferentes enzimas (tirosinasa, elastasa, colagenasa y lipoxigenasa), en los extractos de una selección de 150 plantas presentes en el Parque Nacional de Doñana, para ello se recolectaron ejemplares de 150 especies vegetales presentes en el Parque Nacional de Doñana y su entorno, realizando extracciones de estos usando disolventes de diversa polaridad y capacidad extractante: hexano, etanol, agua: etanol (1:1, v/v) y acetato de etilo. Dichos métodos fueron aplicados para evaluar la capacidad de inhibición enzimática así como capacidad antioxidante en dicha colección de 150 plantas y en muestras seleccionadas de los ensayos de exposición justificando como era de esperar el aumento de la capacidad inhibidora a las enzimas en las muestras sometidas a altas concentraciones de disoluciones dopantes. Estableciendo una relación metabólica entre las posibles moléculas bioactivas de los extractos de las plantas que no están documentados en la bibliografía por su actividad de inhibición enzimática y los inhibidores conocidos de dichas enzimas, explicando así la existencia de la actividad inhibidora.