Anàlisi de biomarcadors neuropeptídics en fluids biològics per SPE-CE-MS

Resumen

La determinació de biomarcadors peptídics en fluids biològics resulta de gran interès pel diagnòstic, la monitorització i el pronòstic de nombrosos desordres. En aquesta tesi doctoral s’han explorat diverses metodologies d’extracció en fase sòlida acoblada en línia amb l’electroforesi capil•lar amb detecció per espectrometria de masses (SPE-CE-MS) per a l’anàlisi de biomarcadors peptídics, que es troben a baixa concentració en matrius complexes. S’han estudiat principalment pèptids opiacis que estan relacionats amb desordres neurològics i síndromes de dolor crònic. S’han avaluat diverses fases estacionàries comercials per a l’anàlisi de pèptids opiacis per SPE-CE emprant preconcentradors amb frits i la fase estacionària C18 és la que ha proporcionat millors resultats per a l’anàlisi de mostres de plasma humà. La saturació del preconcentrador s’ha previngut mitjançant un tractament de mostra previ que consta de dues etapes, una precipitació amb acetonitril seguida d’una filtració per centrifugació. Com que l’etapa de filtració és crítica per tal d’obtenir les màximes recuperacions dels anàlits i eliminar la matriu de la mostra, s’han provat filtres de diversos talls moleculars i diverses condicions de filtració. L’acoblament de la SPE-CE a un espectròmetre de masses amb analitzador de temps de vol (TOF-MS) mitjançant una interfase amb líquid auxiliar convencional ha permès disminuir els LOD per a la majoria dels pèptids opiacis en mostres de plasma humà. Per tal de poder detectar concentracions inferiors, s’ha demostrat que la combinació de la SPE-CE amb la tècnica de separació electroforètica isotacoforesi transitòria (tITP) és una bona alternativa. També, s’ha comparat el comportament de preconcentradors amb i sense frits per a l’anàlisi de pèptids opiacis per C18-SPE-CE-UV i C18-SPE-CE-TOF-MS. S’ha avaluat un prototip recentment desenvolupat d’una interfase nanoelectroesprai (nanoESI) sense líquid auxiliar basada en una punta porosa per a l’anàlisi de pèptids opiacis per CE-MS i també, s’ha establert una metodologia de C18-SPE-CE-TOF-MS emprant un innovador preconcentrador sense frits compatible amb les dimensions específiques del capil•lar de separació requerit per a la interfase nanoESI sense líquid auxiliar. Una altra possibilitat per a millorar la detecció de pèptids és utilitzar fases estacionàries amb una selectivitat més elevada que el C18, com les fases estacionàries d’immunoafinitat. S’han explorat dos procediments de preparació d’aquest tipus de fases estacionàries: la immobilització d’anticossos intactes oxidats (immunoglobulina G, IgG) a través dels carbohidrats a partícules de sílice activades amb grups hidrazida i la immobilització de fragments d’IgG (fragment d’unió a l’antigen, Fab’) a partícules de sílice activades amb grups succinimidil. Seguint els procediments establerts, s’ha preparat una fase estacionària amb IgG i una altra amb Fab’ contra les endomorfines 1 i 2 (End1 i End2). S’han optimitzat i avaluat metodologies d’IA-SPE-CE-TOF-MS per a l’anàlisi de mescles de patrons d’End1 i d’End2 i s’han analitzat mostres de plasma humà. També, s’ha explorat l’aplicabilitat d’una fase estacionària d’immunoafinitat amb IgG per a l’anàlisi de biomolècules d’elevat pes molecular per IA-SPE-CE-TOF-MS emprant la glicoproteïna transferrina com a model.