Mecanismos reguladores en la asimilación de distintas fuentes de nitrógeno, orgánicas e inorgánicasEn el organismo modelo chlamydomonas reinhardtii

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis: Las algas son organismos fotosintéticos presentes en una gran diversidad de ecosistemas. Estos organismos son los productores primarios dominantes en la tierra y tienen un papel primordial en la producción de O2, fijación de CO2, ciclo del nitrógeno (N) y en la estabilización de los ecosistemas. Sin embargo, su alta capacidad de proliferación en condiciones de exceso de nutrientes, como las producidas por la contaminación de diferentes nichos acuáticos, también es la causa de la eutrofización de estos ecosistemas. Desde un punto de vista biotecnológico, algunas algas tienen un alto valor debido a su interés alimenticio, nutracéutico y su capacidad de producir compuestos de valor añadido. Chlamydomonas reinhardtii es una microalga verde que se ha desarrollado como un organismo modelo y que ha permitido conocer a nivel bioquímico, genético y molecular una gran cantidad de procesos biológicos, entre los que destacamos la asimilación de nitrógeno (N). Esta microalga también ha permitido abordar las bases para entender las interacciones mutualistas con bacterias, basadas en el intercambio de carbono (C) por nitrógeno. En las últimas décadas, Chlamydomonas también ha emergido como un organismo con un gran potencial biotecnológico en procesos de biorremediación y producción de biocombustibles. Chlamydomonas, al igual que las plantas, puede utilizar fuentes de N inorgánico como amonio (NH4+), nitrato (NO3-) y nitrito (NO2-) y orgánico (aminoácidos, urea, úrico, etc.). Sin embargo, existe una preferencia de unas formas de N sobre otras, que obedece a mecanismos reguladores. Además, en condiciones de exceso de N (fundamentalmente NO2-), las algas pueden generar el gas de efecto invernadero óxido nitroso (N2O). En este trabajo hemos intentado avanzar en el estudio de cómo el NO3-, como nutriente o como molécula señal, impacta en otras rutas en Chlamydomonas. En primer lugar, estudiamos la desasimilación de NO3-/NO2- a N2O (Capítulo 1). En segundo lugar, abordamos el papel del NO3-, como molécula señal, sobre la asimilación del nitrógeno orgánico, la acumulación de almidón, lípidos, compuestos carotenoides, y clorofila (Capítulo 2). Finalmente, un análisis transcriptómico, junto con un estudio de promotores y de factores de transcripción, nos ha permitido sugerir nuevos papeles reguladores mediados por NO3- y NIT2 (Capítulo 3). 2.Contenido de la investigación: Capítulo 1. El óxido nitroso (N2O) es un potente gas de efecto invernadero cuya producción y liberación está aumentado considerablemente durante las últimas décadas, en gran parte por causas antropogénicas. Para el estudio de la desasimilación de NO3-/NO2- hasta N2O por microalgas, nos hemos planteamos los siguientes objetivos. 1) Búsqueda de genes implicados en dicho proceso que estén presentes en los genomas de algas (NIRK, CYP55, FLV y HCP) y el establecimiento/validación de una estrategia para estudiar la desasimilación de NO3-/NO2- a N2O en Chlamydomonas. Para ello se ha utilizado la metodología de espectroscopia CRDS (Cavity Ring-Down Spectroscopy) que permite monitorizar las concentraciones de N2O y CO2, de forma continua, y hemos usado estirpes de Chlamydomonas en las que se ha interrumpido la asimilación de NO3-/NO2- mediante la mutación NO2- reductasa (NiR). Esto nos ha permitido conocer el papel de diferentes actores involucrados en este proceso de desasimilación como son NIT2 (el regulador maestro de la asimilación de NO3-); NIT1/NIA1 (NO3- reductasa), ARC/NOFNiR (Nitrito reductasa formadora de NO que funciona junto a la NR), CYP55 y FLV (NO reductasas, mitocondrial y cloroplástica, respectivamente). Los resultados han permitido proponer que el complejo NR/ARC tiene un gran impacto en las emisiones de N2O tanto en luz como en oscuridad, a través de la producción de NO. Que ambas CYP55 y FLV son necesarias, como NO reductasas, para que se produzcan altas emisiones de N2O. Dado que FLV y CYP55 tienen localizaciones diferentes, se sugiere que debe existir una coordinación mitocondria-cloroplasto para dicho proceso. Además, en este Capítulo hemos estudiado cómo estas condiciones que favorecen la producción de N2O impactan en el metabolismo central de las algas y afectan las emisiones de CO2. Capítulo 2. El papel de NO3- como señal, independiente de su asimilación, se ha estudiado en estirpes de Chlamydomonas que no pueden reducir NO3- a NO2-, pero donde se genera una situación diferente a la falta de N. Los resultados indican que muchos de estos efectos del NO3- están mediados por el gen regulador NIT2 y determinan una inhibición de la gametogénesis, inhibición de la asimilación de formas de nitrógeno orgánico, evita la degradación de la clorofila y permite mantener una actividad fotosintética apropiada, y a la vez sintetizar más almidón, pero menos triacilglicéridos (TAGs). El mantenimiento de los niveles de DGDG (DiGalactosylDiacylGlycerol; un lípido de la membrana del tilacoide), compuestos carotenoides y clorofila apoyan al efecto de NO3-/NIT2 en la protección del aparato fotosintético. En presencia de NO3-, la estirpe carente de NR está impedida para asimilar fuentes orgánicas de N. El trabajo realizado en este Capítulo nos ha permitido aislar mutantes afectados en un componente de señalización, aún por identificar, cuya alteración permite revertir específicamente la regulación negativa por NO3-/NIT2 para la asimilación de N orgánico. Capítulo 3. En este Capítulo, se ha realizado un análisis transcriptómico que nos ha permitido estudiar los niveles de transcritos de aquellas rutas que se han estudiado en los Capítulos 1 y 2. Se han determinado los patrones de expresión de genes que estarían regulados positiva y negativamente por NO3- y NIT2, entre los que se incluyen los implicados en la desasimilación de NO2- y la asimilación de N orgánico. Finalmente, un análisis de promotores y estudio de expresión de Factores de Transcripción (FTs) en respuesta a NH4+, NO3- o deficiencia de nitrógeno, ha permitido proponer modelos de regulación para algunas de las rutas estudiadas. 3.Conclusión: Los mutantes de nitrito reductasa constituyen una buena herramienta para los estudios de desasimilación y emisiones de nitroso a partir de nitrito y necesita la acción concertada del complejo NR-ARC (en el ctosol), FLV (en el cloroplasto) y CYP55 (en la mitocondria). Durante este proceso de desasimilación, el intermediario NO, altera las emisiones de dióxido de carbono. Esto es consecuencia de un desbalance en la metabolización de carbono. EN luz, el acetato genera dióxido de carbono, y este sería ineficientemente fijado por el aparato fotosintético. El nitrato como una señal independiente de su asimilción y mediada por NIT2 estaría regulando los siguientes procesos en Chlamydomonas: inhibe la gametogénesis, protege la actividad fotosintética manteniendo no solo los niveles de clorofila y de carotenoides sino también de DGDG. Una mayor actividad fotosintética favorecería la fijación de dióxido de carbono y la síntesis de almidón en vez de TAG. Inhibe la asimilación de fuentes orgánicas de N y explica las preferencias de fuentes de nitrógeno en el alga (nitrato vs nitrógeno orgánico). 4. Bibliografía: Burlacot, A., Richaud, P., Gosset, A., Li-Beisson, Y., Peltier, G., 2020. Algal photosynthesis converts nitric oxide into nitrous oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117, 2704¿2709. https://doi.org/10.1073/pnas.1915276117 Calatrava, V., Tejada-Jimenez, M., Sanz-Luque, E., Fernandez E., Galvan A. Nitrogen Metabolism in Chlamydomonas (a). 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