New tools for Genetic Engineering of MicroalgaeReprogramming the carotenoid biosynthetic pathway in the Chlorophyte Chlamydomonas reinhardtii

Resumen

Las microalgas han atraído la atención de la industria por su diversidad bioquímica y metabólica, son consideradas fuentes renovables y sostenibles de una amplia variedad de productos, como lípidos, péptidos, polisacáridos, proteínas recombinantes o carotenoides, entre otros. Los carotenoides son un grupo diverso de compuestos isoprenoides lipofílicos, apreciados por sus propiedades pro-vitamínicas, antioxidantes, secuestradores de radicales libres y colorantes, que juegan un importante role en la salud humana y animal. A pesar del potencial biotecnológico de las microalgas, muchos de estos compuestos son producidos en pequeñas cantidades, en fase estacionaria o bajo condiciones estresantes de cultivo, que reducen su productividad. La ingeniería genética es una potencial herramienta para obtener microalgas mejoradas con más altas eficiencias de producción o que son capaces de acumular proteínas recombinantes, como vacunas y otras proteínas terapéuticas. En el Capítulo 1, se muestra el diseño y la validación de un nuevo plásmido de expresión multicistrónica llamado Phyco69. Este plásmido muticistrónico contiene el pequeño péptido autohidrolizable FMDV2A fusionado entre la región polilinker y la secuencia del gen marcador APHVIII que permite la expresión simultánea de dos genes bajo el control de un mismo promotor (HSP70A/RbCS2). El diseño de Phyco69 asegura la selección de células con mayores niveles de expresión de ambos genes (GOI y APHVIII) y la expresión estable de transgenes en microalgas siempre que se mantenga bajo presión selectiva. En el Capítulo 2, se presenta un nuevo gen marcador, CRTIop, para la selección de células transformantes de microalgas, basado en la resistencia al herbicida blanqueantes norflurazon. Este nuevo gen marcador se basa en el gen bacteriano que codifica para la enzima fitoeno desaturasa y que, a diferencia de la fitoeno desturasa (PDS) de algas y plantas, no es inhibida por la acción del herbicida. La versión sintética del gen CRTI, adaptada al uso de codones de C. reinhardtii fue transformada mediante perlitas de vidrio. Los resultados demostraron que CRTIop es un gen marcador eficiente en esta microalga. Se ha demostrado la posible utilización de este gen como un marcador selectivo para otras microalgas, tanto marinas como de agua dulce. Finalmente, en el Capítulo 3, el sistema CRISPR-Cas9 se ha utilizado para realizar el knock-out del gen PDS en Chlamydomonas reinhardtii, obteniendo células que acumulan fitoeno. En este trabajo, se han diseñado dos complejos ribonucleoproteicos-Cas9 (RNO-PDS1, RNP-PDS2) para dirigirse al primer exón del gen PDS y escindirlo. Numerosas colonias blancas fueron obtenidas, seleccionando 7 para estudios de PCR y secuenciación que revelaron mutaciones insercionales en el sitio diana que generaron knock out del gen PDS. Se seleccionó el mutante knock-out ΔE10 para realizar ensayos de HPLC, mostrando que el carotenoide fitoeno fue el único detectado en esta línea mutante. Análisis de microscopía óptica mostraron que tanto la línea parental como la knock-out ΔE10 tienen una forma similar. Sin embargo, la microscopía electrónica de transmisión reveló que las células mutantes presentaban una estructura atípica del cloroplasto, con la presencia de membrana plastidial pero no con apilamiento de membranas tilacoidales. Finalmente, el análisis transcriptómico reveló agrupación de genes diferencialmente expresados en grupos funcionales relacionados con la síntesis de proteínas y péptidos, la traducción, fotosíntesis y biosíntesis de tilacoides y componentes de fotosistemas que afectan a otros procesos celulares importantes, como la asimilación de CO2 o la funcionalidad de los flagelos.