Especiación quiral de moléculas bioactivas en leche materna y de fórmula por HPLC-MAD-HG-AFS y HPLC-MS

Resumen

El estudio de moléculas bioactivas en productos de interés alimentario, sanitario o clínico tiene un gran interés. En particular es de gran importancia disponer de herramientas analíticas que permitan caracterizar y evaluar cuantitativamente la presencia de estas sustancias, por su repercusión en el metabolismo y en la salud. Entre los alimentos la leche materna ocupa un lugar primordial para los seres vivos en general, y para los seres humanos en particular, ya que este cubre las primeras necesidades nutritivas, de aporte de principios activos y de protección inmunológica del recién nacido. El uso cada vez más pronunciado de leche de fórmula que suplan las carencias de leche materna constituye también una cuestión de gran interés, ya que estas deben ser totalmente equivalentes a la leche procedente de la madre. Entre los posibles componentes en la leche materna los elementos esenciales tienen una importancia básica siendo destacable el papel que ocupan las trazas metálicas. De forma especial interesa saber las formas químicas en que se encuentran estas trazas ya que su acción metabólica y su capacidad de asimilación (biodisponibilidad ) depende de forma determinante de ello. Una faceta muy importante en estudios de este tipo es la caracterización de formas quirales, ya que determinados enantiómeros serán los que permitan que estos metabolitos desarrollen su acción. El presente trabajo se centra en el desarrollo de metodología analítica para la especiación quiral de formas de selenio, en particular la selenometionina en leche materna y de fórmula e inicia, al mismo tiempo, la caracterización del proteoma del suero de la leche materna. En este sentido se enumeran los resultados más relevante alcanzados a lo largo del trabajo: Se ha desarrollado un acoplamiento HPLC-MAD-HG-AFS para la especiación quiral de selenometionina en leche materna y de fórmula, introduciendo etapas de limpieza de la muestra y preconcentración de los analitos. El procedimiento final es sensible y preciso para el análisis de enantiomeros de selenometionina en leche. La sensibilidad analítica del acoplamiento HPLC-MAD-HG-AFS para la L-selenometionina es 3.1 ^g L*'(como Se) y D-selenometionina (3.5 ng L ), utilizando disoluciones de estos compuestos en agua. Los valores análogos obtenidos en el sistema HPLC-ICP-MS, 0.8 ug L"1 como Se, para ambas especies quirales indican una mayor sensibilidad del detector ICP-MS. Sin embargo, cuando el sistema HPLC-ICP-MS se aplica a muestras de leche, las recuperaciones disminuyen y el sistema instrumental desarrollado en el presente capítulo permite alcanzar mejores resultados. Posiblemente el la capacidad discriminante que proporciona los múltiples tratamientos post-columna en este acoplamiento (HPLC-MAD-HG-ADS) reduce la influencia de la matriz. La aplicación del sistema HPLC-MAD-HG-AFS al análisis de leche materna ha revelado que la L-selenometionina representa una contribución del 70% al total de selenio presente en este tipo de muestra. En la leche de fórmula también se ha encontrado cierta cantidad de D-selenometionina. Los resultados obtenidos confirman la aplicabilidad del procedimiento desarrollado a este tipo de muestras y la posibilidad de uso futuro de la metodología al estudio de rutina de la leche materna y en el control de calidad de la leche de fórmula. Debido a las características del suero de leche materna, la precipitación de las proteínas es un paso esencial para obtener un método de separación de las proteínas adecuado, con una buena resolución, usando 2D-PAGE. Se han usado dos métodos distintos de tinción: Coomasie y plata. El primero de ellos ha generado geles de mayor calidad para el propósito de este estudio, por lo que los geles teñidos con Coomasie fueron los elegidos para evaluaciones posteriores. Más de 150 manchas fueron visibles a lo largo de los seis replicados estudiados de los geles de suero de leche materna. La mayoría de las manchas aparecieron en un rango de pH de 4-7 y sus masas estuvieron comprendidas entre 20-100 kDa. Fueron analizadas 120 manchas y un total de 115 fueron identificadas mediante MS/MS usando la búsqueda a través de las bases de datos del MASCOT y la búsqueda de homologías del BLAST. Después de realizar este estudio cabe destacar lo siguiente: (i) en algunos casos, las proteínas que tienen el mismo nombre en las bases de datos no poseen secuencias idénticas. Así, de 115 manchas conteniendo proteínas identificadas, 58 diferentes proteínas fueron identificadas según su nombre y 63 diferentes proteínas en función de la similitud de las secuencias; (ii) es usual encontrar una proteína en cada mancha del gel. Sin embargo, en 18 manchas se han encontrado mas de una proteína identificada; (iii) existen diferentes manchas en el gel que poseen la misma proteína según el nombre y la secuencia. Así, fueron identificadas 36 proteínas diferentes que representaban 99 isoformas.